资讯 | 科研人员揭示dna糖基化酶在核小体上的碱基切除机制-pg电子官方

北京大学生命科学学院高宁教授课题组在cell discovery上发表了题为“structural and mechanistic insights into the dna glycosylase aag-mediated base excision in nucleosome”的研究论文。论文利用冷冻电镜技术阐明了dna糖基化酶（dna glycosylase）在核小体（nucleosome core particle，ncp）不同位置上的碱基切除机制。

真核生物的碱基切除修复（base excision repair，ber）可以定位和修复染色质中的dna损伤。基因组dna中含有大量外源损伤剂诱导和自发分解反应造成的dna碱基损伤。dna糖基化酶可以识别并切除损伤的dna碱基，生成一个无嘌呤/无嘧啶的位点（ap site），这个位点可以被核酸内切酶ape1切割并在dna上产生一个缺口。随后的修复过程可以通过dna聚合酶、dna连接酶以及相关蛋白质因子通过两种途径修复（short-patch and long-patch ber pathways）。

烷基腺嘌呤dna糖基化酶aag（3-methyladenine dna glycosylase）可以识别包括3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-ma），7-甲基鸟嘌呤（7-methylguanine，m7g），氧化腺嘌呤1,n6-乙醇腺嘌呤（1，n6-ethenoadenine, εa）和脱氨腺嘌呤次黄嘌呤（hypoxanthine）在内的碱基损伤。在人类中，aag的表达改变与微卫星不稳定性、自发移码突变和多种癌症有关。在小鼠模型中，aag敲除小鼠容易发生和结肠直肠癌，而在aag过表达的小鼠中，过度的aag活性会导致肝毒性、致死和其它烷基化诱导毒性。

dna的碱基损伤可以发生在染色质化的真核生物基因组的所有区域，包括核小体dna位点。核小体作为天然的屏障会阻碍ber相关蛋白对损伤位点的接触，只有一部分面向溶剂侧的dna自由暴露。广泛的体外研究表明，ber因子可以选择性地定位并结合到核小体中的不同损伤位点。一般来说，aag在某一位点的活性和该位点的可接触性正相关，研究证实与组蛋白核心区域相互接触的dna具有更高的突变率，这可能由于ber因子与损伤碱基低的接触性密不可分。在结构上，损伤碱基的可接触性取决于其在核小体上的平移位置和旋转方向，面对溶剂的损伤碱基确实比封闭和嵌入的损伤碱基更容易被修复。以往的结构研究主要聚焦在dna糖基化酶对裸露dna上的修复机制，但这些蛋白质如何克服核小体施加的障碍来定位和修复核小体中的dna碱基损伤尚不完全清楚。本研究将模拟损伤的碱基（deoxyinosine，di）设计在核小体dna的不同位置上，包括不同的超螺旋（superhelical locations，shls）和旋转方向上（图1a），这些位置分别代表了不同的shls上相似性的位置（-30、-50）和同一个shl上不同旋转方向上导致的溶剂可及性不同的位置，包括完全暴露（-50），封闭（-53）和嵌入（-55）的位置上。通过冷冻电镜技术分别解析了四种包含损伤碱基的核小体结构（apo-state）以及核小体和dna糖基化酶aag的复合物结构（post-catalytic state）。

图1 aag-ncp-30ap复合物示意图

结构分析表明在线性或者核小体dna底物上，aag都使用一组同样的保守氨基酸残基进行相互作用，并且作用模式比较相似（图1b—g）。重要的是，通过与不包含di的ncp结构比较，作者发现仅存在一个di核苷酸就足以全面扰动核小体dna的结构，导致核小体dna和组蛋白核心之间的包埋表面积减少，并且无论受损碱基的位置如何，这些核小体dna的整体扰动都处于相似的模式：由di引起的dna形变在核小体dna出口附近最为明显。

进一步的结构分析发现，在形成的稳定aag-ncp复合物中（包括-30、-50、-53），ncp的损伤位点都已变成了apsite，处于催化后状态（post-catalytic state）。在这些aag-ncpap复合物中，aag的结合导致受损碱基周围的核小体dna发生非常显著但相对局部的扭曲，根据受损部位的平移和旋转位置，aag利用不同的机制接触损伤的碱基。（1）对于具有高溶剂可及性的完全暴露的dna损伤碱基，aag具有很高活性，能直接接触这些损伤碱基，在结构上直接增加dna的局部扭曲以识别损伤位点（图2a）。（2）对于具有中等溶剂可及性的封闭的dna损伤碱基，aag的活性相比于完全暴露位置的aag活性低，aag诱发剧烈的局部的dna扭曲，并且为了接触到修复碱基，还需要dna的旋转和包含约1bp的位移去缓解核小体的造成空间障碍（图2b）。（3）对于溶剂可及性极低的深埋位置的dna损伤碱基，局部dna扭曲和有限的核小体dna位移不足以完全暴露埋藏的碱基。此时，被di整体扰动的核小体可能更容易自发展开（nucleosome breathing），aag可以利用这一特性来捕获分离的末端dsdna并使这一过程不轻易可逆。因此，在这些完全深埋的位点中，核小体dna的部分开放可能是aag的招募和催化的先决条件（图2c）。

图2 aag介导的核小体碱基切除的示意图

综上所述，本研究解析了包含不同位置损伤的核小体结构以及核小体和dna糖基化酶aag的结构，揭示了碱基损伤对核小体稳定性的影响，为理解dna糖基化酶aag如何利用核小体的结构动力学参与核小体中的dna碱基损伤修复提供了一个机制框架。在更广泛的背景下，这些数据也有助于理解其它的dna结合蛋白如何调控核小体的结构动力学来发挥其分子功能。（来源：）