资讯 | 科研人员揭示dna糖基化酶在核小体上的碱基切除机制-pg电子官方
北京大学生命科学学院高宁教授课题组在cell discovery上发表了题为“structural and mechanistic insights into the dna glycosylase aag-mediated base excision in nucleosome”的研究论文。论文利用冷冻电镜技术阐明了dna糖基化酶(dna glycosylase)在核小体(nucleosome core particle,ncp)不同位置上的碱基切除机制。
真核生物的碱基切除修复(base excision repair,ber)可以定位和修复染色质中的dna损伤。基因组dna中含有大量外源损伤剂诱导和自发分解反应造成的dna碱基损伤。dna糖基化酶可以识别并切除损伤的dna碱基,生成一个无嘌呤/无嘧啶的位点(ap site),这个位点可以被核酸内切酶ape1切割并在dna上产生一个缺口。随后的修复过程可以通过dna聚合酶、dna连接酶以及相关蛋白质因子通过两种途径修复(short-patch and long-patch ber pathways)。
烷基腺嘌呤dna糖基化酶aag(3-methyladenine dna glycosylase)可以识别包括3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-ma),7-甲基鸟嘌呤(7-methylguanine,m7g),氧化腺嘌呤1,n6-乙醇腺嘌呤(1,n6-ethenoadenine, εa)和脱氨腺嘌呤次黄嘌呤(hypoxanthine)在内的碱基损伤。在人类中,aag的表达改变与微卫星不稳定性、自发移码突变和多种癌症有关。在小鼠模型中,aag敲除小鼠容易发生和结肠直肠癌,而在aag过表达的小鼠中,过度的aag活性会导致肝毒性、致死和其它烷基化诱导毒性。
dna的碱基损伤可以发生在染色质化的真核生物基因组的所有区域,包括核小体dna位点。核小体作为天然的屏障会阻碍ber相关蛋白对损伤位点的接触,只有一部分面向溶剂侧的dna自由暴露。广泛的体外研究表明,ber因子可以选择性地定位并结合到核小体中的不同损伤位点。一般来说,aag在某一位点的活性和该位点的可接触性正相关,研究证实与组蛋白核心区域相互接触的dna具有更高的突变率,这可能由于ber因子与损伤碱基低的接触性密不可分。在结构上,损伤碱基的可接触性取决于其在核小体上的平移位置和旋转方向,面对溶剂的损伤碱基确实比封闭和嵌入的损伤碱基更容易被修复。以往的结构研究主要聚焦在dna糖基化酶对裸露dna上的修复机制,但这些蛋白质如何克服核小体施加的障碍来定位和修复核小体中的dna碱基损伤尚不完全清楚。本研究将模拟损伤的碱基(deoxyinosine,di)设计在核小体dna的不同位置上,包括不同的超螺旋(superhelical locations,shls)和旋转方向上(图1a),这些位置分别代表了不同的shls上相似性的位置(-30、-50)和同一个shl上不同旋转方向上导致的溶剂可及性不同的位置,包括完全暴露(-50),封闭(-53)和嵌入(-55)的位置上。通过冷冻电镜技术分别解析了四种包含损伤碱基的核小体结构(apo-state)以及核小体和dna糖基化酶aag的复合物结构(post-catalytic state)。
图1 aag-ncp-30ap复合物示意图
结构分析表明在线性或者核小体dna底物上,aag都使用一组同样的保守氨基酸残基进行相互作用,并且作用模式比较相似(图1b—g)。重要的是,通过与不包含di的ncp结构比较,作者发现仅存在一个di核苷酸就足以全面扰动核小体dna的结构,导致核小体dna和组蛋白核心之间的包埋表面积减少,并且无论受损碱基的位置如何,这些核小体dna的整体扰动都处于相似的模式:由di引起的dna形变在核小体dna出口附近最为明显。
进一步的结构分析发现,在形成的稳定aag-ncp复合物中(包括-30、-50、-53),ncp的损伤位点都已变成了apsite,处于催化后状态(post-catalytic state)。在这些aag-ncpap复合物中,aag的结合导致受损碱基周围的核小体dna发生非常显著但相对局部的扭曲,根据受损部位的平移和旋转位置,aag利用不同的机制接触损伤的碱基。(1)对于具有高溶剂可及性的完全暴露的dna损伤碱基,aag具有很高活性,能直接接触这些损伤碱基,在结构上直接增加dna的局部扭曲以识别损伤位点(图2a)。(2)对于具有中等溶剂可及性的封闭的dna损伤碱基,aag的活性相比于完全暴露位置的aag活性低,aag诱发剧烈的局部的dna扭曲,并且为了接触到修复碱基,还需要dna的旋转和包含约1bp的位移去缓解核小体的造成空间障碍(图2b)。(3)对于溶剂可及性极低的深埋位置的dna损伤碱基,局部dna扭曲和有限的核小体dna位移不足以完全暴露埋藏的碱基。此时,被di整体扰动的核小体可能更容易自发展开(nucleosome breathing),aag可以利用这一特性来捕获分离的末端dsdna并使这一过程不轻易可逆。因此,在这些完全深埋的位点中,核小体dna的部分开放可能是aag的招募和催化的先决条件(图2c)。
图2 aag介导的核小体碱基切除的示意图
综上所述,本研究解析了包含不同位置损伤的核小体结构以及核小体和dna糖基化酶aag的结构,揭示了碱基损伤对核小体稳定性的影响,为理解dna糖基化酶aag如何利用核小体的结构动力学参与核小体中的dna碱基损伤修复提供了一个机制框架。在更广泛的背景下,这些数据也有助于理解其它的dna结合蛋白如何调控核小体的结构动力学来发挥其分子功能。(来源:)