前沿 | 华中农大彭楠团队开发首个来自古菌的tnpb微型基因编辑工具-pg电子官方

基于crispr-cas9或cas12a的基因编辑工具已经得到广泛应用，成为推动生命科学、现代农业、医学和合成生物学等领域快速发展的重要动力。但是，基因编辑工具的应用仍面临巨大挑战。例如， 由于cas9及cas12a核酸酶系统分子量巨大（通常大于1000个氨基酸），限制了递送效率等。更重要的是，由于缺乏crispr-cas9及cas12a的底层知识产权，基于该系统的基因编辑技术成为我国基因编辑应用的“卡脖子”技术难题。

2023年11月11日，华中农业大学彭楠教授课题组在 cell discovery 期刊发表了题为：reprogramming an rna-guided archaeal tnpb endonuclease for genome editing 的研究论文。

该研究开发了全球首个来自古菌域的rna引导的微型编程性核酸酶系统——sistnpb1，可在多种不同生长温度的微生物中实现高效基因编辑，有望为现代生物育种提供自主知识产权的高效基因编辑工具。

目前，所有cas9及cas12a等编程性核酸酶均来自细菌。而古菌编码的编程酶没有得到有效发掘。

在这项研究中，彭楠教授课题组从古菌sulfolobus islandicus rey15a中鉴定了23个is200/605家族编码的tnpb编程酶性核酸酶。该酶具有分子量小（40 kda）、与已报道的rna引导的编程性核酸酶同源性低（<30%）等特点，具有开发成自主知识产权基因编辑工具的巨大潜力。

研究团队通过生信分析，准确预测了引导rna（grna）结构和识别靶标dna的序列以及引发tnpb切割的tam（transposon-associated motif）序列。通过纯化其中一个典型的tnpb（命名为sistnpb1）及其结合的grna核糖核蛋白复合物（rnp）进行体外核酸切割实验，发现sistnpb1在较广的温度活性范围内（37-85℃）均具有活性，其中最适温度在65-75℃之间。

此外，sistnpb1具有tam依赖的切割特异性并且是mg2 和mn2 依赖特性。通过测序分析切割产物，发现其与cas12家族蛋白具有相似的dna交错切割特点，突变sistnpb1的ruvc域的任意保守氨基酸均严重降低其切割活性。通过对靶标dna碱基突变分析，表明靶标序列最关键的“种子”序列位于 1到 10的位置，且靶标序列 1核苷酸突变强烈抑制sistnpb1 rnp的切割活性。此外，sistnpb1只需一个不保守的tam序列（5 '-wnhnn-3 '）即可用于引发靶标dna的切割。

研究团队在细菌体内验证了sistnpb1的靶向切割活性。通过设计靶向质粒等外源遗传元件的grna，sistnpb1系统可以在细菌体内37℃条件下实现特异性切割并消除这些遗传元件。最终，该团队将sistnpb1系统开发成为全球首个来自古菌的微型基因编辑工具，在乳酸片球菌（37和45℃）及冰岛硫化叶菌（75℃）中实现了精确的基因编辑，编辑效率>90%。研究团队申请了中国发明专利和pct专利各一项。

鉴定全球首个来自古菌的微型编程酶性核酸酶系统sistnpb1并开发为高效的基因编辑工具

华中农业大学生科院徐颖博士研究生为该论文第一作者，刘涛博士后为论文第二作者，彭楠教授为论文通讯作者。（来源：）

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41421-023-00615-2